מלנומה

אנטיגנים, נוגדנים וקומפלקסים חיסוניים נוטלים חלק חשוב במהלך המלנומה, בניטור התקדמות המחלה ובתכנון הטיפול . ההתקדמות שחלה בעת האחרונה בהבנת האימונוביולוגיה של המלנומה הביאה לזיהויים ולאיפיונם של אנטיגנים רבים הקשורים במחלה

 (TUMOR ASSOCIATED ANTIGENS;  TAA ). אנטיגנים המבוטאים על פני תאי מלנומה עשויים להיות דומים או זהים לאנטיגנים על פני מלנוציטים תקינים, או שונים לחלוטין מבחינה אימונוביולוגית [70]. קיים מספר גדול של מולקולות, אשר התבטאותן על פני תאי המלנומה קשורה לשלבי המחלה השונים ולדרגת ההתמיינות של התאים. ככל שתאי המלנומה בעלי דרגת בשלות נמוכה יותר, הדמיון האנטיגני בינם לבין המלנוציטים התקינים קטן יותר. יתרה מזאת, מאחר ואנטיגנים ספציפיים נמצאים על פני מלנוציטים מרקמות פיגמנטריות שונות, כגון כורואיד או נבוס עורי, ניתן לנסות ולקבוע את מקורה של מלנומה מפושטת באמצעות זיהוי האנטיגנים הללו. כמו כן, אנטיגנים שונים עשויים להמצא בשלבים שונים של המחלה ולשמש כסמנים להישנות המחלה או להתקדמותה. ענין מיוחד נמצא במולקולות ההצמדה התאיות

(CELL  AND MATRIX ADHESION MOLECULES ) , גורמי צמיחה (GROWTH FACTORS), ציטוקינים, טירוזינאז, גליקופרוטאינים, פרוטאזות, גנגליוזידים, אנטיגנים של מבנה תואם הרקמות (MAJOR HISTOCOMPATIBILITY  COMPLEX TYPE I AND II MOLECULES). תאי מלנומה בתרביות רקמה מבטאים אנטיגנים  שלא נמצאים בהכרח על פני תאים המבודדים ממלנומה בחולה, ככל הנראה בעקבות תגובות בין-תאיות והשפעות סביבתיות תוך-גופיות.

אנטיגנים הקשורים במלנומה (MELANOMA ASSOCIATED ANTIGENS ).

רוב האנטיגנים הקשורים במלנומה נחקרו בתרביות תאים יותר מאשר ברקמה טריה . תאי מלנומה בתרבית מבטאים אנטיגנים של מלנומה בעלי מבנה ותכונות דומים לאנטיגנים בתאי מלנומה שהוסרו מנגע בגוף החולה  [115]. פרוטאוגליקאנים, גנגליוזיד GD3 וגנגליוזיד GD2, אופיינו בגרורות ראתיות וכבדיות של מלנומה שהושרתה בעכברים בעלי חסר חיסוני [46].

רבים מהאנטיגנים הקשורים במלנומה הינם קרבוהידרטים, ובמיוחד גליקוספינגוליפידים. קרבוהידרטים הקשורים בשאתות יכולים להווצר בעקבות סינתיזה לא שלמה של אנטיגנים תקינים, בעקבות שינוי באנטיגן קיים או  בעקבות תהליך ייצור של אנטיגן שאתי חדש לחלוטין. קרבוהידרטים נחלקים ל- 3 קבוצות. האחת כוללת אפיטופים המבוטאים על גליקוליפידים וגליקופרוטאינים המצויים על פני רוב תאי הסרטן בבני אדם כגון סרטן הראה, המעי, השד, הכבד והלבלב. הקבוצה השניה של האפיטופים מבוטאת רק על גליקוליפידים המצויים בתאים של ממאירויות לא-אפיתליאליות בבני אדם כגון מלנומה, לימפומה ע"ש BURKITT, נוירובלסטומה וסרטן הראה מסוג תאים קטנים. הקבוצה השלישית של אפיטופים מבוטאת רק על פני גליקופרוטאינים כגון Tn ו-  SIALOSYL Tn  (פרקורסור של קרבוהידרטים). טרנספורמציה אונקוגנית של גליקוליפידים כוללת ייצור חלקי של גליקוליפידים תקינים עם או ללא הצטברות הפרקורסורים, ייצור מוגבר של של גליקוליפידים סגוליים לגידול, או שינוי במבנים המרכיבים את קרום התא [40].

טרומבוספונדין הוא גליקופרוטאין רב-תפקידים המצוי ברקמת המשתית ובטסיות הדם. טרומבוספונדין מסוגל להגיב עם קרומי תאים, ועשוי למלא תפקיד במנגנון הדבקות התאים (CELL ADHESION), אגרגציה של טסיות הדם, תגובה בין מונוציטים לבין טסיות, רביית תאים, אנגיוגנזיס, זריעת גרורות, ויצירת פרוטיאזות. טרומבוספונדין נקשר לקולטן CD36 המצוי על פני תאי מלנומה ועל תאים המרכיבים את כלי הדם [110].

גורם קרישה מספר 10 במצב משופעל אותר על פני  קרומי תאים של מלנומה, סרטן ראה מסוג תאים-קטנים, וסרטן הכליה. נוכחות הגורם על פני תאים אלה מהווה הוכחה לקיום מנגנון קרישה שלם ויכולת יצירת טרומבין. גורם קרישה מספר 10 משופעל לא אותר על פני תאים של סרטן השד או המעי ולא בתאים בריאים ממקור כבד, ראה, שד, כליה, ושליה [135].

GP57 (מסומן גם כ- (A42 הוא גליקופרוטאין המבוטא על פני קרום תאי המלנומה בשלב מוקדם או ביניים (INTERMEDIATE) של התמיינותם. תפקידו של האנטיגן הוא בתגובות חוץ-תאיות בסביבת המשתית [100].

GP75 הוא אנטיגן גליקופרוטאיני תוך תאי, בעל משקל מולקולרי בטווח של 70 עד 89kD, המצוי על פני קרום המלנוזום. התבטאותו מווסתת באמצעות אותו מנגנון המווסת את התבטאות הטירוזינאז. בתאי מלנומה ובמלנוציטים ייצור האנטיגן מהווה עד 0.6% מכלל ייצור החלבונים החדשים [129]. נוכחותו עשוייה לסייע בהבחנה בין תאי מלנומה בעלי דרגת בשלות גבוהה לתאי מלנומה בעלי דרגת בשלות נמוכה. טירוזינאז ו- GP75 דומים ב- 43% מכלל חומצות האמינו המרכיבות אותם [70]. האנטיגן GP75 זוהה על ידי נוגדנים מסוג IgG בנסיוב חולה במלנומה ממאירה. המיקום התוך תאי של האנטיגן גורם להיותו "מוגן" מפני המערכת החיסונית. למרות זאת, בתאים ממאירים עלול האנטיגן להחשף למערכת החיסונית בזמן מות התאים או התפרקותם, דבר המביא ליצירת נוגדנים נגדו. לכן ניתן לכוון את הטיפולים האימונותרפיים נגד אנטיגן זה [49].

GP100 הוא גליקופרוטאין שבודד לאחרונה [9]. GP100 מזוהה על ידי לימפוציטים בעלי   HLA-A2 שבודדו מתוך נגעים של מלנומה (TIL ) ויכול לשמש מטרה באימונותרפיה.

GP110 הוא גליקופרוטאין בעל משקל מולקולרי של 110kD, המצוי על פני תאי מלנומה לא-בשלים [51]. ייצורו של האנטיגן מושרה על ידי אינטרפרון- SYMBOL 103 \f "Symbol" [99]. אנטיגן אחר, בעל משקל מולקולרי של 100kD, הוא CALLA :   COMMON  ACUTE  LYMPHOBLASTIC  LEUKEMIA  ANTIGEN, הממלא תפקיד בכימוטקסיס [125]. שני האנטיגנים מצויים על פני תאי מלנומה בדרגת בשלות בינונית [70].

GP180 הוא אנטיגן על פני קרום התא, בעל משקל מולקולרי של 180kD, המצוי על פני מלנוציטים בשלים ותאי מלנומה בעלי פיגמנט [52]. ניתן לנצלו בתור סמן למלנומה בעלת דרגת התמיינות גבוהה.

CF21 הוא אנטיגן תוך תאי בעל מיקום זהה לזה של GP75 במלנוציטים בשלים או בתאי מלנומה בעלי דרגת הבשלה גבוהה. בתאי מלנומה בתרבית קיים מתאם בין מידת ההתבטאות של האנטיגן CF21 לבין עצמת הפיגמנטציה של התאים [119].

P97 הוא אנטיגן הקשור במלנומה בבני אדם המשמש מטרה אפשרית לאימונותרפיה. היכולת הציטוטוקסית של תאי T , ששופעלו על ידי אנטיגן זה, נבדקה במודל עכבר.  תאי T מסוג CD4+ סגוליים כנגד אנטיגן נמצאו יעילים כנגד גרורות ראתיות של מלנומה [57].

מערך נוגדנים מונוקלונאליים נגד אנטיגנים גידוליים של מלנומה נוסה כדי להבחין בין מלנומה עורית לבין מלנומה עינית. המלנומה העינית והעורית ביטאו שתיהן אנטיגנים כגון גנגליוזידים ואנטיגן מלנומה רב-משקל (HIGH MOLECULAR WEIGHT MELANOMA ASSOCIATED ANTIGEN,  HMW-MAA) [104]. אנטיגן CF21 חסר במלנומה ממקור הדמית (CHOROID) בעוד שאנטיגן GP75 דווקא מצוי בה. מכאן שניתן להשתמש באנטיגנים רקמתיים אלה לקביעת מקור המלנומה, למשל במצב של מלנומה מפושטת ממקור לא ברור [56,119].

MAGE הם קבוצת אנטיגנים שבודדו לאחרונה, המקודדים על ידי גניםMAGE 1-3   : החלבון MZ2E ע"י MAGE1 ,  ו-  MZ2D ע"י MAGE3. החלבונים מופיעים על פני תאי מלנומה וגם על פני תאים ממאירים אחרים ממקור ראש-צואר, ריאות, קולון, שד, סרקומה, ואף על רקמה מאשך בריא. כל האנטיגנים הללו מזוהים ע"י לימפוציטים בעלי HLA-A1 [32,122,126] . האנטיגן MZ2-Bb  מורכב מהחלבון המקורי המקודד על ידי MAGE1, הקשור לאנטיגן של תאום רקמות מסוג HLA-Cw1601. האנטיגן מבוטא ב- 7% מחולי המלנומה שנבדקו, ועשוי לשמש מטרה לטיפול חיסוני [127]. האנטיגן MZ2-E מורכב מחלבון בעל 9 יחידות, המקודד ע"י MAGE-1, ומוצג על ידי מולקולות HLA-A1 [123]. לאחרונה נמצא כי אנטיגן זה יכול לעורר פעילות של לימפוציטים נגד תאי מלנומה [103].

MART-1 הוא אנטיגן המורכב מ- 118 חומצות אמינו, ומבוטא על פני רוב תאי המלנומה, המלנוציטים והרשתית, בדומה ל- GP100. MART-1 מוצג על ידי מולקולות HLA-A2 (כמו טירוזינאז ו- GP100 , בעל אתר אחד החשוף לזיהוי על ידי לימפוציטים, אולם כושרו של אתר יחיד זה לעורר תגובה חיסונית תאית גבוה מכשרו האימונוגני של כל אנטיגן ידוע אחר [60].

מולקולות הצמדה רבות משותפות לסוגים שונים של תאי סרטן ותאי דם לבנים. נוכחות מולקולות אלה על פני תאי המלנומה מאפשרת הצמדה ספציפית של התאים לתאי אנדותל של כלי דם, כשלב ראשון של התהליך הגרורתי.

אינטגרינים הם קבוצה של מולקולות על פני שטח התא, הנחוצות לתגובות בין-תאיות, לקשר בין הסביבה לבין התא, להשרדות התא ולתהליך הפיזור הגרורתי. האינטגרין  SYMBOL 98 \f "Symbol"3/SYMBOL 97 \f "Symbol"v עולה בריכוזו על פני שטח התא בשיעור של פי 50 עד 100 בד בבד עם העליה בכושר הפיזור הגרורתי של התאים. העליה בהתבטאות אינטגרין זה מביאה להגברת הכושר לספוח פיברונקטין ופיברינוגן אל התאים,  ולהגיב עם טסיות דם, תאי אנדותל ומשתית חוץ-תאית [33]. האינטגרין  SYMBOL 98 \f "Symbol"3/SYMBOL 97 \f "Symbol"v אינו ייחודי אך ורק למלנומה, אבל בתאי מלנומה בתרבית, התבטאותו קשורה בצמיחה לגובה, יותר מאשר בצמיחה לרוחב, ובגוף החולה הוא מבוטא יותר בנגעים נודולריים [4,28]. האינטגרין SYMBOL 98 \f "Symbol"1/SYMBOL 97 \f "Symbol"6 ממלא תפקיד במגע בין-תאי ובמיוחד בין תאי מלנומה ותאי אנדותל, כשלב התחלתי בתהליך המטסטטי [71].

תפקידו של פרוטאוגליקאן CD44, המצוי על פני תאי האנדותל, הוא בקשירת החלבון SYMBOL 98 \f "Symbol"1 המופרש ממאקרופאגים. חלבון SYMBOL 98 \f "Symbol"1 מושך תאי דם לבנים מסוג CD8+ ומצמיד אותם לרקמת המטרה, באמצעות חומצה היאלורונית המצוייה על פני רקמת המטרה. צורות מסוימות של CD44 אופיניות לסרטן גרורתי כגון אדנוקרצינומה ונון-הודגקין לימפומה. למרות ש- CD44 הוא המולקולה המרכזית בתחום האיטגרינים, תפקידו בתהליך הפיזור הגרורתי של המלנומה טרם הובהר די צורכו [71,96].

האנטיגן הקשור במלנומה בבני אדם (MAA HUMAN ) , המזוהה על ידי הנוגדן ME14-D12, מצוי על פני שטח התא. הצגתו מושרית על ידי אינטרפרון גמה. לאחרונה זוהה האנטיגן כמולקולת ההצמדה  ( ICAM-1  )  INTER-CELLULAR ADHESION MOLECULE -1   [42]. ביטוי ה- ICAM-1   במלנומה עולה הן על פני קרום התא והן בצורה מסיסה בנסיוב כאשר השאת נמצאת בשלב מתקדם או גרורתי . חולי מלנומה מפרישים כמות גדולה של ICAM-1 לנסיוב, בניגוד לאנשים בריאים, ורמה זו בנסיוב נמצאת בהתאמה לשלב המחלה. ככל שהרמה בנסיוב גבוהה יותר, כך שלב המחלה מתקדם יותר [6,55]. בשאת הכליה ובלימפומה של תאי B נמצאה התאמה הפוכה בין הרמה בנסיוב לבין שלב המחלה [55]. הפרשת ה- ICAM-1 בצורתו המסיסה  למדיום או לנסיוב, בתנאי מעבדה או בגוף החולה, בהתאמה, מושרית על ידי ציטוקינים [11,35].

מולקולות הצמדה רבות מוצגות על פני קרום תא המלנומה. נוכחותן מאפשרת קיום תגובה חיסונית-תאית נגד תאי המלנומה. התגובה התאית נמצאת בהתאמה לריכוז מולקולות אלה על פני המלנומה. הצגתן של מולקולות הצמדה חלשות על פני המלנומה מהווה ככל הנראה חלק ממנגנון ה"בריחה"  (ESCAPE) של השאת מהמערכת החיסונית [96].

(MAJOR HISTOCOMPATIBILITY ANTIGENS- CLASS  II   ).

מולקולות HLA-C נמצאות על פני תאים בשיעור קטן בהרבה (10%) מאשר מולקולות HLA-A או B, כנראה משום שמולקולות HLA-C אינן נקשרות היטב למיקרוגלובולין SYMBOL 98 \f "Symbol"2 . פפטידים אנטיגניים רבים מוצגים על ידי מולקולות HLA-A ו- B , ובודדים על ידי C  (כמו למשל HLA-CW1601 ).

את"ר II אותרו על פני תאי מלנומה בעלי פנוטיפ המתאים לשלב ראשוני או אמצעי של המחלה [51,88]. התבטאות מולקולות HLA-DR מתאימה לפרוגנוזה רעה [21]. הצגה מוגברת של HMB-45 ושל HLA-DR נצפתה בהתקדמות התאים ממלנוציטים תקינים לכוון מלנוציטים אטיפיים . יש לציין כי שומה אטיפית מכילה מערך אנטיגני דומה יותר לשומה שפירה מאשר למלנומה ממאירה [132]. תגובה כלפי האנטיגן HMB-45 מרמזת על יצירת מלנוזומים ועל דיפרנציאציה של מלנוציטים, אך אינה מסוגלת להבחין בין מלנוציטים תקינים לבין תאי מלנומה [111].

מלנומה מוקדמת מעוררת תגובה של תאי T כלפי האנטיגנים הסרטניים, ההולכת ונחלשת ככל שהמחלה מתקדמת. תאי מלנומה בשלב מוקדם של המחלה מסוגלים להציג את האנטיגנים הסרטניים, כגון TAA, לתאי T מסוג CD4+. יכולת זו אובדת עם התקדמות המחלה , ככל הנראה עקב שינויים והפרעות במולקולות את"ר II . בעת התקדמות המחלה חלים שינויים בתוצרי הגן HLA-DRSYMBOL 98 \f "Symbol"1 , הגורמים להם לאבד את יכולתם להציג אנטיגנים לתאי T [5].

גליקוזאמינוגליקאן סולפאט (SULFATED GLYCOSAMINOGLYCAN  )

מולקולות אלה מאפיינות תאים בעלי יכולת פיזור גרורתי. תאים משאת בעלת יכולת פיזור גבוהה מציגים יותר מולקולות של הפאראן סולפאט.  בשלב מוקדם של ההתמיינות מציגים תאי מלנומה יותר מולקולות של כונדרואיטין סולפאט. כונדרואיטין סולפאט הוא פוליפפטיד במשקל מולקולרי של 240 עד מעל 500 קילודלטון, הבנוי משלד ועליו מורכבות מולקולות רבות של  כונדרואיטין סולפאט. ביטוי שונה של אפיטופים פרוטאוגליקאניים נמצא בתאי מלנומה. הפאראן סולפאט וכונדרואיטין סולפאט לעיתים קרובות מראים פעילות ביולוגית הפוכה בהצמדת תאים או בוויסות רביית התא. תוך כדי ההתקדמות לקראת שלב ממאיר יותר, רמת הכונדרואיטין סולפאט יורדת, ורמת ההפאראן סולפאט עולה. מולקולות הפאראן סולפאט נמצאות קשורות לקרום התא רק במקרים של מלנומה ממאירה במיוחד. העליונות הכמותית של הפאראן סולפאט על פני כונדרואיטין סולפאט יכולה לשמש מדד או סמן (MARKER ) להתקדמות המחלה [70,120 ).

אנזים גליקופרוטאיני המכיל נחושת, בעל משקל מולקולרי של 75KD , המכונה מולקולה T4. טירוזינאז מיוצר על ידי מלנוציטים באפיתל, רירית, רישתית וגוף ציליארי, אגור בגופיפים (מלנוזומים) בציטופלסמה, ומשמש לייצור פיגמנט [31,43 ). מלנין נוצר בתגובת חימצון של חומצת אמינו L -טירוזין  ע"י טירוזינאז [101]. ייצור מלנין מווסת על ידי איזון בין טירוזינאז, TRP-1 (TYROSINASE RELATED PROTEIN 1 ), האנזים DOPA CHROME TAUTOMERASE  ואנזים נוסף המעכב יצירת מלנין [58,124]. טירוזינאז מבוטא על פני מלנומה בכמות גדולה בעיקר בשלבים מתקדמים של המחלה. מלנוציטים בשלים, שלא בדומה לתאים בשלים אחרים, מסוגלים ליצור מלנין במלנוזומים. סמנים לבשלות המלנוציט קשורים בתהליך יצירת המלנין. פעילות טירוזינאז בנסיוב חולים במלנומה מפושטת דווח ע"י מחברים אחדים [2,91,112]. תאי מלנומה בתרבית במצע נוזלי הפרישו טירוזינאז למצע [59], ולכן מתקבל על הדעת שטירוזינאז המצוי בנסיוב חולים במלנומה מקורו בתאי השאת.

שני אנזימים בעלי פעילות טירוזינאז בודדו ממלנוציטים שמקורם ברקמות בעלות פיגמנט [54,107,134]. לשניהם רצפים דומים של חומצות אמינו [131]. האחד הוא טירוזינאז קשור לקרום המלנוציט, ומהווה למעשה את רוב הטירוזינאז המצוי ביונקים. השני הוא טירוזינאז מסיס, המופרש מהתאים אל הנסיוב, ומצוי בכמות פחותה מהראשון [131].

נוגדנים חד שיבטיים נגד תאי מלנומה מכירים צורות ברורות של טירוזינאז [73,121], של אנטיגנים הקשורים במלנומה [3,128] , ושל אנטיגנים הקשורים בפיגמנט [118]. חלק מהאנטיגנים משמשים מטרות לתגובה חיסונית בחולי מלנומה, בחולי בהקת אוטואימונית, ובחולי מלנומה עם התפתחות איזורי התבהרות (דמויי בהקת) [37,89].

תאי מלנומה בעלי יכולת הצגת אנטיגנים למערכת החיסונית התאית, ויכולת הפרשת ציטוקינים כחלק מתהליך התפתחות התגובה החיסונית כלפי המחלה [12,93 ]. תאי מלנומה רגישים לפעילות ציטוקינים שונים, הן מבחינת התבטאות אנטיגנים על פני קרום התא, והן מבחינת קצב צמיחת השאת. אינטרפרון גמה הוא הציטוקין היעיל ביותר להשראת התבטאותם של אנטיגנים שונים הקשורים במלנומה (TAA ). ביטויו של גורם צמיחה ממקור אפידרמלי (EPIDERMAL GROWTH FACTOR ) על פני תאי המלנומה מושרה אף הוא על ידי אינטרפרון גמה, וכן על ידי גורם נמק השאת – אלפא (TUMOR NECROSIS FACTOR ALFA ) תוך 72 שעות הדגרה של תאי מלנומה בנוכחות הציטוקינים [86]. הצמדות התאים מוגברת על ידי אינטרפרון גמה, גורם נמק השאת אלפא, אינטרלויקין 1SYMBOL 98 \f "Symbol" , בעוד שביטוי האנטיגנים הקשורים במלנומה  (TAA ) ירד בתגובה לאינטרפרון גמה. טיפול בציטוקינים הביא ליצירת רב-גוניות בתאי השאת (TUMOR HETEROGEITY  ) ולעיכוב בצמיחת השאת. צירוף של 2 ציטוקינים הביא לשינויים מוגבלים במערך האנטיגני בהשוואה להשפעתו של ציטוקין בודד. לעומת זאת, השילוב של גורם נמק השאת אלפא ושל אינטרפרון גמה היה יעיל יותר נגד שגשוג השאת מאשר כל אחד לחוד [83 ].

התבטאותו של הקולטן ל- EGF עולה עם המעבר ממלנוציט שפיר לתא מלנומה , בשאתות ממקור אנוש. נוכחותו ורמתו של הקולטן נמצאת בהתאמה לשלב המחלה ולמידת ממאירות התאים. תאי מלנומה מנגעים עוריים שטחיים ובלתי-פולשניים על פי רוב חסרי קולטנים ל- EGF, לעומת תאים מנגעים גרורתיים, המציגים על פניהם קולטנים ל- EGF בריכוז גבוה. 19% מהשומות, 61% מהשומות הדיספלסטיות, 89% מהנגעים המלנוטיים הראשוניים בעור ו- 91% מהנגעים הגרורתיים נמצאו בעלי קולטנים ל- EGF [22]. טרם הובהר אם נוכחות קולטן ל- EGF מקנה יתרון כלשהו לתאים מנגע גרורתי על פני תאים מנגע עורי ראשוני.

טיפול באינטרפרון- SYMBOL 103 \f "Symbol" או באינטרפרון SYMBOL 98 \f "Symbol"- סרין לבד או בתשלובת הביא להגברת היצור וההפרשה לנסיוב של  CEA ושל גליקופרוטאין  72 – GP  ב- 65%  מהחולים עם שאת ממקור אפיתיאלי. בחולים עם ממאירות לא-אפיתליאלית כמו לויקמיה של תאים שעירים, או מלנומה ממאירה, טיפול באינטרפרון לא שינה את התבטאותם של אנטיגנים אלה [36]. הנקודה המעניינת היא שחוסר הגברת ההתבטאות של האנטיגנים הללו קשור דווקא בתגובה טובה יותר של לויקמית תאים שעירים או מלנומה, לטיפול חיסוני על ידי אינטרפרון.

קיום נוגדנים בנסיובי חולים במלנומה הודגם ב- 35% מחולי מלנומה בשיטות שונות כגון: הרג תאי מלנומה אוטולוגיים על ידי תאים לבנים לאחר קשירת משלים, צביעה אימונופלורסצנטית של ציטופלסמה של תאים הרוגים או של קרומי תאים חיים [67]. שני סוגי נוגדנים למלנומה זוהו. הסוג האחד הוא נוגדן סגולי לכל שאת, הפעיל נגד אנטיגנים המצויים על פני קרום התא, והשני הוא נוגדן המגיב עם אנטיגנים ציטופלסמטיים , והמצוי ברוב חולי המלנומה [67].

בנסיובי חולים במלנומה נמצא נוגדן מסוג IgM המכוון נגד גנגליוזידים GD2 [117]. הוצע שנוכחות נוגדן נגד גנגליוזידים הוא סמן לפרוגנוזה טובה יותר. נוגדן נגד GM3 הושרה על ידי חיסון חולי מלנומה עם תערובת של  GM2 ו- BCG [117]. תאי מלנומה גרורתית ממקור אדם מציגים אנטיגן משותף לתאי האנדותל בכל הרקמות הבריאות. נוגדנים נגד מלנומה עשויים להגיב עם תאי האנדותל במקום עם תאי המלנומה, ובכך להיות מסולקים ממחזור הדם.

שני מנגנונים עשויים להסביר את התפשטות המלנומה (ואולי אף את התפשטותם של גידולים אחרים) בחולה עם מערכת חיסונית תקינה. האחד הוא יצירת נוגדנים חוסמים, המגיבים עם האנטיגן על פני תא המטרה, ובכך מונעים את הצגתו של האנטיגן לתאי הדם הלבנים, ואת חיסול התא הממאיר. המנגנון השני הוא  ייצור נוגדנים  כנגד נוגדנים סגוליים לגידול, המשמשים כנוגדנים חוסמים [68].

נוכחות קומפלכסים חיסוניים בנסיובי החולים במלנומה עשוייה להסביר את חוסר האפשרות להדגים קיום נוגדנים חופשיים בכייל גבוה. תבחין חיסוני לגילוי קומפלכסים חיסוניים הוצע על ידי Gupta and Morton [39]. נוגדן חד-שבטי ממקור עכבר הופק נגד גליקופרוטאין של מלנומה (TAA ) שזוהה על ידי נוגדנים מחולי מלנומה. האפיטופ על האנטיגן הגליקופרוטאיני שזוהה על ידי הנוגדן העכברי היה שונה מהאפיטופ שהוכר על ידי הנוגדנים מחולי המלנומה. הנוגדן העכברי לא הגיב עם אנטיגנים מנסיוב-אדם בריא, ולכן התבחין לא הבדיל בין חולי מלנומה ובין אנשים בריאים.   ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY  (ELISA) היא שיטה נוספת לזיהוי קומפלכסים חיסוניים. הקומפלכסים החיסוניים זוהו באמצעות ELISA ב- 58% מחולי מלנומה ולא באף אחד מהמתנדבים הבריאים [50]. הוצע [38,133] כי קומפלכסים חיסוניים עשויים לשמש כסמנים למחלה סמויה. 69% מחולי מלנומה בשלב I עם מחלה חוזרת פיתחו קומפלכסים חיסוניים, לעומת 80% מחולי מלנומה באותו שלב, אך ללא עדות להישנות המחלה, אצלם לא נמצאו קומפלכסים חיסוניים.  הזמן הממוצע שחלף בין מציאת הקומפלכסים החיסוניים בנסיוב לבין הופעת מחלה גלויה היה 23±28 חודשים, למעט מקרה חריג של 12 שנים [133].

זיהוי האנטיגנים על פני קרומי תאי המלנומה הביא ליצירת נוגדנים חד-שבטיים נגד מלנומה בתנאי מעבדה. נוגדנים חד-שבטיים נגד אנטיגנים של מלנומה יכולים לשמש לצרכים טיפוליים בבני אדם. השראת תגובה חיסונית של הגוף כנגד המלנומה או כנגד הנוגדן החד-שבטי הקשור לתאי השאת מהווה מטרה בנסיון הטיפולי [44].

נוגדנים חד-שבטיים מסוגים שונים (IgG,IgM,IgA ) נגד אנטיגנים של מלנומה יוצרו באמצעות תאי מיאלומה שהורכבו עם תאים לימפטיים מקשרי לימפה ומטחול של חולה מלנומה. הנוגדנים IgG,IgA  היו פעילים רק נגד תאי מלנומה, והנוגדן IgM הגיב גם עם תאים סרטניים ממקור מעי גס, ערמונית, לבלב וראות. הנוגדנים הגיבו בעיקר עם אנטיגנים תוך-תאיים מאשר עם אנטיגנים שעל פני קרום התא [1].

נוגדנים חד-שבטיים נגד גליקופרוטאינים המצויים על פני קרום התא נמצאו כבעלי חשיבות קלינית קטנה, בין אם פעלו בעצמם או הוצמדו לרעלן או לחומר רדיואקטיבי. לעומת זאת, נוגדנים נגד גליקוליפידים על פני תאי מלנומה נמצאו, בניסוי קליני מהשלב הראשון, יעילים מבחינה רפואית נגד מלנומה [114].

נוגדן חד-שבטי כנגד האנטיגן   HIGH MOLECULAR WEIGHT MELANOMA ASSOCIATED ANTIGEN  צומד לרעלן הצמחי SAPORIN-6 . התצמיד (CONJUGATE ) קטל באופן בררני רק תאי מלנומה שהיציגו אנטיגן זה על פניהם [119]. נוגדנים חד-שבטיים נגד גנגליוזידים (GD2 ) מצומדים עם הרעלן הצמחי GELONIN [87] ונוגדנים חד-שבטיים מצומדים למטוטרקסאט (MTX) הראו פעילות ציטוטוקסית נגד מלנומה [34].

נוגדנים נגד מלנומה ובהקת (VITILIGO) אוטואימונית

בהקת הינה מחלה עורית המתאפיינת בהופעה של איזורי התבהרויות (HYPOPIGMENTA‎TION ) על פני העור [72,92], והמצאות נוגדנים נגד מלנוציטים בנסיובי החולים [45]. הנוגדנים ממלאים ככל הנראה תפקיד בהווצרות הבהקת [19]. כייל הנוגדנים נגד מלנוציטים נמצא בהתאמה למידת התפשטות המחלה ולמידת מעורבות העור. נוגדנים נמצאו ב- 50% מהחולים עם בהקת ממוקמת (פחות מ- 5% שטח עור נגוע) , אולם ב- 93% מהחולים עם בהקת מפושטת. [90]. הכייל הממוצע של הנוגדנים למלנוציטים עולה עם העליה בפעילות המחלה ובמידת מעורבות העור [82]. בבהקת אוטואימונית נוצרים נוגדנים נגד אנטיגנים של מלנוציטים תקינים ושל רקמות אחרות כגון אדרנל, תירואיד, תירוגלובולין, תאים פריאטליים, תאי לבלב, הגורמים לתופעות מצד המערכות המעורבות. נוגדנים נגד רקמות שונות ממלנוציטים לא הודגמו בחולי מלנומה [30]. בעבודה שבוצעה במעבדתנו (לא במסגרת העבודה הנוכחית) נוגדנים נגד מלנוציטים נקשרו גם לתאי מלנומה, ובנוכחות משלים, הביאו לפירוקם של תאי המלנומה. יתרה מזאת, כאשר הוזרקו נוגדנים, שבודדו מנסיובים של חולי בהקת, לעכברים אצלם הושרו גרורות ראתיות של מלנומה, נצפתה נסיגה מרשימה של הגרורות [30]. מרתקת היא האפשרות (תיאורטית בשלב זה) להזריק לחולי מלנומה גרורתית נוגדנים, שהופקו מנסיובים של חולים בבהקת אוטואימונית !!

אנטיגנים של מלנומה יכולים לשמש למטרות חיסון בתנאים מסוימים. הנוגדנים הנוצרים נגד אנטיגנים של מלנומה אינם דורשים זיהוי על ידי מערכת את"ר (MHC ‎ ) [105]. ניתן לתת חיסון פעיל על ידי הזרקת תאי גידול מעובדים ישירות לחולה [44].

Kawakami וחב' [60] מצאו שאותם אנטיגנים של מלנומה, המזוהים על ידי תאי T ציטוטוקסיים, היו קיימים במלנומות מחולים בעלי HLA שונים. תצפית זו מהווה למעשה את הבסיס ההגיוני למתן חיסון נגד מלנומה תוך שימוש במאגר-אנטיגנים ממקורות שונים. ציטוטוקסיות התלויה בקשירת משלים התבצעה, לעומת זאת, אך ורק נגד תאים שנלקחו מאותו חולה, ולא נצפתה נגד תאים שנלקחו מחולי מלנומה אחרים [117].

תגובות בודדות נצפו בחולי מלנומה שטופלו על ידי אנטיגנים עצמיים (AUTOLOGOUS TAA ) מוחדרים בתוך ליפוזומים. התכשיר הביא לעירור לימפוציטים מדם היקפי כאשר נבדק בתנאי מעבדה [97].

אימונותרפיה סגולית פעילה (ACTIVE SPECIFIC IMMUNOTHERAPY ) על ידי תאי מלנומה אנושיים מוקרנים הגבירה את התגובה החיסונית הנוגדנית (הומורלית). נוגדנים נגד מלנומה מסוג

IgG,IgM ,IgA  נצפו בכייל גבוה יותר לאחר הזרקת החיסון [1].

תכשיר חיסוני המכיל אנטיגנים שונים ניתן לחולי מלנומה בשלבים III או IV . אנטיגנים משותפים לתכשיר ולשאת בחולה הביאו להתפתחות תגובה חיסונית נוגדנית ותאית נגד האנטיגנים. יצורו של נוגדן מסוג  IgM , המכוון נגד אנטיגנים על פני קרום תאי מלנומה מסוג M14 , הושרה ב- 62% מהחולים בעקבות החיסון. היתרון בהשרדות היה משמעותי הן בשלב III והן בשלב IV, ונמצא במתאם (קורלציה) עם ייצור IgM , אך לא עם ייצור IgG [84].

חיסון חולי מלנומה בעזרת גנגליוזיד GM2 או אנטיגן סרטני ממקור אפיתליאלי סיאלוזיל- TN הביא לייצור ניכר של נוגדן מסוג IgM ברוב החולים, ולייצור IgG רק באחדים מהם [69]. האנטיגנים GD3 והאנטיגן "הגבה-מולקולרי" (HIGH MOLECULAR WEIGHT MELANOMA   ASSOCIATED ANTIGEN)  עשויים למלא תפקיד חשוב בחיסון נגד מלנומה [105]. גנגליוזידים אחרים וקרבוהידרטים נמצאו פחות יעילים למטרות חיסוניות. הגברת יכולתם של תאי מלנומה לעורר את המערכת החיסונית ניתנת לביצוע על ידי שימוש בחומרים מסייעים (ADJUVANT) , בנוגדנים אנטי-אידיוטיפיים (ANTI-IDIOTYPIC ANTIBODIES) , ועל ידי קשירת האנטיגנים של המלנומה לאנטיגנים אחרים חזקים יותר [69].

מתן חיסון נגד מלנומה, המבוסס על תגובה תאית נגד אנטיגנים שהופקו מהמלנומה באותו חולה, מוגבל בדרך כלל עקב מיעוט רקמת השאת המוצאת מהגוף לשם כך. דרך חדשה להתגבר על קושי זה היא השימוש בנוגדנים אנטי-אידיוטיפיים.

מולקולות של נוגדנים נושאות בעצמן איזורים בעלי תכונות אנטיגניות, המסוגלים לעורר תגובה חיסונית כנגדם. האיזור האנטיגני על פני הנוגדן, כלפיו מתבצעת התגובה החיסונית, נקרא אידיוטיפ. הנוגדן הנוצר כנגד האידיוטיפ נקרא נוגדן אנטי-אידיוטיפי [62]. Jerne הניח שתגובה חיסונית נגד גירוי אנטיגני כלשהו מווסתת על ידי רשת (NETWORK) של תגובות אידיוטיפ – אנטי-אידיוטיפ [53]. נוגדן אנטי-אידיוטיפי (נוגדן- 2 או Ab2) הוא נוגדן המסוגל להגיב רק עם נוגדן- 1 (Ab1) – הנוגדן נגד האנטיגן הסגולי שכנגדו הוא נוצר. נוגדנים אנטי-אידיוטיפיים דומים במבנה האנטיגני שלהם לאנטיגן המקורי של המלנומה, ומסוגלים להגיב עם נוגדן- 1. במקרה כזה מגדירים את הנוגדן- 2 כתמונת הראי (MIRROR IMAGE ) של האנטיגן הסגולי. הנוגדן האנטי-אידיוטיפי מכוון נגד האתר קושר האנטיגנים על פני נוגדן- 1 . קשירת הנוגדן האנטי-אידיוטיפי  לנוגדן- 1 ניתנת לעיכוב על ידי הדגרה קודמת של נוגדן- 1 עם האנטיגן המסוים. האתר על פני האנטיגן אליו נקשר הנוגדן נקרא פאראטופ (PARATOPE ) . הפאראטופ יכול להיות דומה לאידיוטיפ או שונה ממנו. הנוגדן האנטי-אידיוטיפי מחקה את האנטיגן במבנהו. התגובה החיסונית נגד הנוגדן האנטי-אידיוטיפי חזקה יותר מהתגובה החיסונית נגד האנטיגן הראשוני. במילים אחרות, חיסון בעזרת נוגדן- 2 אמור להביא ליצירת נוגדנים המכוונים נגד האנטיגן המסוים על פני המלנומה [62].

מלנומה ממאירה נבחרה לבדיקת יעילותם הטיפולית של הנוגדנים האנטי-אידיוטיפיים מאחר וזוהי שאת אימונוגנית, המגיבה לאימונותרפיה, אם כי באופן חלקי [10]. תאי מלנומה מציגים על פניהם את האנטיגן ה"גבה-מולקולרי"  (HIGH MOLECULAR WEIGHT MELANOMA-ASSOCIATED ANTIGEN) בכמות גדולה. השוני באנטיגן זה בין חולה אחד לחולה אחר קטן, ונוכחותו על פני מלנוציטים תקינים מעטה ביותר [79]. האנטיגן ה"גבה-מולקולרי" משמש לכן מטרה טובה לטיפולים חיסוניים פעילים או סבילים [62]. בעבודה שדווחה על ידי Ferrone ו- Kageshita  [29] , 24 חולים במלנומה ממאירה בשלב גרורתי חוסנו באמצעות נוגדן אנטי-אידיוטיפי (נוגדן- 2) חד-שבטי שהוכן כנגד נוגדן- 1, המכוון בעצמו נגד האנטיגן ה"גבה-מולקולרי". תגובה חלקית נצפתה בחולה אחד, ותגובה מינימלית או התייצבות המחלה נצפו בשמונה חולים נוספים. Mittleman וחב' [80] השתמשו בנוגדן אנטי-אידיוטיפי ממקור עכבר  (MoAb MF 11-30 ) המזהה אידיוטופ על פני האתר קושר- האנטיגנים של נוגדן עכברי נגד האנטיגן ה"גבה-מולקולרי" . הנוגדן האנטי-אידיוטיפי החד-שבטי היווה למעשה את תמונת הראי של האנטיגן ה"גבה-מולקולרי", והיה מסוגל לעורר תגובה חיסונית-נוגדנית נגד האנטיגן ה"גבה-מולקולרי". כל החולים פיתחו נוגדנים נגד נסיוב עכבר, אולם תופעות לוואי, כמו רגישות יתר או דלקת מקומית באתר ההזרקה, לא נצפו כלל, אפילו לאחר הזרקות חוזרות של התכשיר. תגובה נצפתה ב- 7 חולים בגרורות עוריות ובאיברים פנימיים.

הרחבת הידע בתחום האימונוביולוגיה של המלנומה הובילה לאיפיונם של נוגדני שאת רבים tumor associated antigens  ולחקר יחסי הגומלין בינם לבין המערכת החיסונית של החולה. למלנומה קשר הדוק עם המערכת החיסונית בגוף החולה, המתאפיין לעיתים על ידי נסיגה  עצמונית של הנגעים במקרים אחדים, אפשרות לתקופה ממושכת בה קיימת המחלה בצורה סמויה  (dormant) ולפתע מתפרצת, נוכחות של נוגדנים ציטוטוקסיים נגד מלנומה בנסיוב החולים, ותגובה לא מבוטלת של מלנומה לטיפול חיסוני על ידי הזרקת תאי מלנומה אוטולוגיים מוקרנים או מתן אינטרפרון או אינטרלויקין 2.

 תאי מלנומה בתרבית מבטאים אנטיגנים רבים על פני שטחם, אשר רק חלקם מתבטא גם בהיות הגידול בגופו של החולה, ככל הנראה עקב השפעות בין-תאיות וגורמים סביבתיים [94]. קיימות מולקולות אנטיגניות רבות על פני קרום תאי המלנומה. עם החשובות שביניהן נימנות מולקולות הצמדות molecules) (cell and matrix adhesion , קולטנים לגורמי גדילה  ((growth factors ולציטוקינים, מולקולות מפרקות חלבון (proteases) , גנגליוזידים (gangliosides) , ואנטיגנים של תאום רקמות  (major histocompatibility class I or II molecules)       [75].

אחד הקשיים הניצבים בפני הרופא האונקולוג המטפל בחולים עם מלנומה הוא גילוי מוקדם של מחלה חוזרת מקומית-איזורית או מפושטת-מערכתית, וניטור התגובה לטיפול. שלא כבמחלות סרטניות אחרות, כדוגמת סרטן השד, הראה, השחלה או הערמונית, הניתנות לניטור גם באמצעות סמן  ביוכימי נוח וזול לבדיקה, אין ברשותו של האונקולוג סמן ייחודי למלנומה ממאירה. המעקב והניטור מתבססים אפוא על בדיקה גופנית, שאינה יעילה לגילוי מוקדים פנימיים, כמו גרורות בריאות, ועל אמצעי הדמייה. אלה כוללים צילומי רנטגן, מיפויים באמצעות חומרים רדיואקטיביים או סריקה ממוחשבת . יתרונם של אמצעי ההדמייה הוא דיוקם ויכולתם לאתר מוקדים סמויים מן העין. חסרונם הבולט הוא כושר ההפרדה  (רזולוציה) המוגבל יחסית. מוקד בקוטר 2-3 מ"מ לא יאותר במקרים רבים. בדיקת נוכחותו של הסמן הביוכימי בנסיוב החולה רגישה, פשוטה וזולה יותר. עלייה ברמת הסמן בנסיוב חולה בסרטן שד, למשל, עשוייה להקדים את גילוי הופעתן של גרורות ע"י אמצעי הדמייה שונים, בחודשים רבים [77].

בעבודתנו בדקנו רמת נוגדנים נגד תאי מלנומה בנסיוב חולים עם מלנומה בשלבים שונים של המחלה, הטיפול והמעקב. הנחתנו היתה כי קיים הבדל בין רמת הנוגדנים בנסיוב בין אדם בריא לבין חולה מלנומה, ובין חולי המלנומה קיים הבדל ברמת הנוגדנים במעבר משלב לשלב, כלומר ממחלה ממוקמת למחלה מפושטת. הנחנו גם כי טיפול כימי ובעיקר טיפול חיסוני משפיעים על רמת הנוגדנים בנסיוב.  על פני תאי המלנומה IN-VIVO  מתבטאים אנטיגנים רבים ושונים, נגדם מגיבה המערכת החיסונית של החולה, ויוצרת נוגדנים בכייל לא ידוע. לפי הספרות, בתרבית תאים נשמרים בדרך כלל רוב האנטיגנים המופיעים על פני התאים הממאירים בגוף [115]. מאחר ולא נעשה איפיון אנטיגני לכל אחד מהחולים טרם ביצוע התבחין, וכדי לנסות ולזהות שינויים בכייל של מגוון רחב של נוגדנים אפשריים בנסיוב החולים, לא התמקדנו בשלב הראשון בחיפוש אחר נוגדנים לאנטיגן מסוים, אלא בדקנו רמת נוגדנים נגד תאי מלנומה בכלל. מסיבה זו לא בצענו ספיחה של נוגדנים נגד אנטיגנים של תאום רקמות על פני לימפוציטים, כפי שנעשה ע"י MORTON וחבריו [84].

            בעבודתנו לא נמצאו הבדלים ברמת הנוגדנים נגד תאי מלנומה B16 או M14 בנסיובים מאנשים בריאים לבין נסיובים מחולי מלנומה. לא ניתן היה לאפיין מצב של מלנומה על פי בדיקת רמת הנוגדנים נגד תאי מלנומה בנסיוב בעזרת ELISA. יתרה מזאת, לא נמצא כל הבדל משמעותי ברמת הנוגדנים  נגד תאי מלנומה בנסיובי החולים   עם מחלה ממוקמת לבין חולים עם מחלה איזורית או מערכתית, ראשונית או חוזרת. בדיקת רמת הנוגדנים נגד תאי מלנומה בנסיוב החולה איננה יכולה לשמש למעקב אחר התקדמות המחלה או נסיגתה, ולא כל שכן לשמש לגילוי מוקדם של מחלה גרורתית. בנוסף, לא נמצא כל הבדל ברמת הנוגדנים נגד תאי מלנומה לפני טיפול כימי או חיסוני ולאחריהם. שיטה זו אינה יעילה לניטור הטיפול הניתן לחולה נגד מלנומה. התגובה לטיפול, המתבטאת בנסיגת השאת, אינה מתבצעת ככל הנראה באמצעות המערכת החיסונית הנוגדנית (הומורלית), ע"י עליה בכייל הנוגדנים, אלא באמצעות זרוע אחרת של המערכת.

כשלוננו במציאת נוגדנים חופשיים נגד תאי מלנומה בנסיובי חולים עם מלנומה בכייל שונה מאוכלוסיית הבקורת הבריאה יכול להיות מוסבר ע"י תגובה של הנוגדנים עם אנטיגנים תאיים שהושרו (shedded )  מתאי המלנומה ויצירת קומפלכסים אימוניים [67,68, 39]. אפשרות נוספת הינה ספיחת הנוגדנים לאנטיגנים על פני תאי השאת וחסימתם מפני פעולת המערכת החיסונית [68]. נוגדנים אלה יכולים גם להקשר ולהרוס מלנוציטים תקינים וליצור איזורי התבהרות (MELANOMA ASSOCIATED HYPOPIGMENTATION ) . ירידה ברמת האנטיגנים או שינוי במבנה האנטיגן, או ירידה בכושרה של המערכת החיסונית להגיב נגד אנטיגנים זרים עשויים גם כן לגרום לרמת נוגדנים נמוכה cנסיוב. אלא מאי, חולים ללא נוגדנים הניתנים למעקב עדיין יכולים להגיב לחיסון עם תאי מלנומה אוטולוגיים ע"י יצירת נוגדנים נגד מלנומה [68,84]. בנוסף לכך לא נמצאו נוגדנים נגד אנטיגנים תאיים כלשהם על פני קרומי תאי מלנומה טריים שנלקחו מגרורה טריה [68].

מחברים שונים טענו שנוגדנים נגד מלנומה נמצאים חופשיים בנסיוב רק בשלבים התחלתיים של המחלה, והולכים ונעלמים עם התקדמותה [67,85]. תוצאותינו מראות כי גם בשלבים ראשוניים של מחלה, כגון T1N0M0  או T2N0M0 לא ניתן היה למצוא נוגדנים נגד מלנומה. ייתכן ונוגדנים אלה נמצאים רק בשלבים התחלתיים בהם המחלה עדיין סמויה מן העין.

טירוזינאז מבוטא בריכוז גדול על פני שטח תאי מלנומה במיוחד בשלבים המתקדמים של המחלה. עד כה בודדו 2 אנזימים הקשורים לקרום תא המלנומה. שני האנזימים דומים ברצף חומצות האמינו המרכיבות אותם, ומראים פעילות של טירוזינאז [54,107,131,134] . אחד מהם מופרש למצע הגידול,  או לחילופין לנסיוב החולה, ויכול לשמש מדד לפעילות המחלה. חשיפת האנזים למערכת החיסונית מביאה לייצור נוגדנים נגדו, אותם זיהינו באמצעות ELISA.

נוגדנים נגד טירוזינאז נבדקו בנסיובי חולים במלנומה, חולים במלנומה עם איזורי התבהרות, חולים בבהקת אוטואימונית ובמתנדבים בריאים. נמצא כי כייל הנוגדנים נגד טירוזינאז בחולים עם מלנומה גרורתית היה גבוה מהכייל בחולים ללא עדות למחלה, וגבוה באופן מובהק מהכייל במתנדבים בריאים. הצפיפות האופטית הנמוכה שנמצאה במתנדבים בריאים, נובעת כנראה מכייל נמוך של נוגדנים נגד טירוזינאז, שנוצרו עקב חשיפה של המערכת החיסונית לטירוזינאז במהלך פרוק נורמלי של מלנוציטים ושחרור טירוזינאז, או נובעת מקריאות רקע עקב ה- ELISA. במטרה לבטל את כל האפשרויות פותחה שיטת החישוב המתבססת על צפיפות אופטית יחסית (ROD ). לפי שיטה זו ממוצע ה- ROD של הבקורת היה 1.000 וזה של החולים במחלה גרורתית 1.516 ושל החולים ללא עדות קלינית למחלה – 1.216 . משמעות הכייל הגבוה בחולים עם מחלה גרורתית לא ברור, אך עשוי לבטא תגובה של המערכת החיסונית  לפיזור של המלנומה. בחולים ללא עדות למחלה הכייל הנמוך מבטא תגובתיות נמוכה יותר של המערכת החיסונית, או שמרמז על פיזור סמוי הגורם לעליה קלה (עדיין) של הכייל. ההבדל בכייל בין חולים עם מחלה גרורתית לבין חולים ללא עדות למחלה  לא היה מובהק. נוגדנים נגד טירוזינאז לא יכולים לכן לשמש כסמן להתקדמות המחלה או להתפתחות הישנות. גם כאשר סווגו החולים לפי אתר הנגע הראשוני ולפי מחלה גרורתית או העדר עדות למחלה (NED ) , לא נמצא כל הבדל בכייל הנוגדנים נגד טירוזינאז. ממצא זה תואם את הממצא הקודם שלא נמצא הבדל ברמת הנוגדנים נגד תאי מלנומה בין חולים בשלבים שונים של המחלה. הממצא שחולים ללא עדות למחלה ומתנדבים בריאים היו בעלי כייל נוגדנים נגד טירוזינאז דומה, עשוי לנבוע מהדמיון הקליני בין 2 הקבוצות: אין עדות למלנומה. חולים ללא עדות למחלה נרפאו, ולכן מצב הנוגדנים אצלם דומה למצב אצל אוכלוסיה בריאה.

מלבד טירוזינאז הוצעו אנטיגנים שונים, הקשורים במלנומה,  על ידי מחברים אחרים כסמנים לפעילות המחלה. אנטיגן השאת בעל תכונות גליקופרוטאיניות  (glycoprotein TAA ) מופרש בשתן חולי מלנומה, ונמצא במתאם להשנות של המחלה. אנטיגן זה אינו יעיל בניטור טיפול או במעקב אחר התקדמות המחלה משלב לשלב, יען כי  רמתו אינה משתנה באופן מובהק בשתן החולה בין אם המחלה ממוקמת או מפושטת באיברים הפנימיים [26].

Thampose ושות' דווחו על מתאם מעניין שנמצא בין נוכחות נוגדנים נגד מלנומה ובין מידת התפשטות המחלה. מבין 24 חולים עם תגובה חיובית לקיום נוגדנים בנסיוב (סרו-פוזיטיביים), היתה מחלה גרורתית רק במקרה אחד. לעומת זאת, מבין 47 חולים עם תגובה שלילית לקיום נוגדנים בנסיוב (סרו-נגטיביים)  היתה מחלה גרורתית ל- 42. השאת היתה מוגבלת לאתר הראשוני ב- 4 חולים עם הוכחה לקיום נוגדנים בנסיוב, אולם כבר לא היתה ממוקמת בכל החולים עם חסרי הנוגדנים בנסיוב. יתרה מזאת, במספר מצומצם של חולים הנוגדנים נעלמו תוך כדי המעקב בד בבד עם התקדמות המחלה [117].

אנטיגנים ונוגדנים אחרים עשויים למלא תפקיד מוגבל כסמנים של מלנומה. גנגליוזידים מסוג GD2 ו GD3 נמצאים בנסיוב החולים ברמה גבוהה יותר מאשר בנסיוב  מתנדבים בריאים, ויכולים לשמש בגילוי המחלה [106]. אינטגרין מצוי על פני קרום התא, ממלא תפקיד בתהליך הפיזור הגרורתי, ומאפיין צמיחה של הנגע הממאיר לגובה ולא לרוחב [4,28]. HMB-45 ו- HLA-DR נמצאים בכמות עולה על פני קרום המלנוציט עם המעבר מצורה שפירה לצורה דיספלסטית או ממאירה, אך לא מאפשרים הבחנה ברורה וחד משמעית בין צורה שפירה למאירה [111,132]. נוכחות  HLA-DR תוארה בקשר לפרוגנוזה טובה ומשך השרדות ארוך יותר [21]. היחס בין האנטיגנים heparan sulphate  ו-  chondroitin sulphate משתנה לטובת הראשון כאשר המחלה אלימה יותר ומתפשטת מהר יותר [120]. התבטאות intercellular adhesion molecule ICAM-1, המסיס בנסיוב, עולה ביחס ישר להתקדמות המחלה ושליחת הגרורות [6,35]. הנוגדן JSI מזהה אנטיגן חלבוני על פני קרום תא המלנומה, ובאמצעותו ניתן לגלות הישנות של המחלה [85]. סמנים אלה, למרות הופעתם הייחודית במצבים מסוימים, אינם מתאימים לשימוש קליני יומיומי. ברוב המקרים מתפתחת המלנומה כנגע חיצוני על פני העור בעל מראה מחשיד, ורק במיעוט המקרים מאובחנת המחלה בשלב גרורתי. בדרך כלל נעשית האבחנה על סמך בדיקה גופנית ובדיקה פתולוגית של תכשיר ניתוחי, ואין צורך בסמן ביוכימי או נסיובי לקביעת האבחנה. הצורך בסמן קיים למטרות מעקב וניטור של טיפול, אולם אינו נענה על ידי רוב הסמנים המוצעים, מאחר וחלקם רקמתיים, או שאינם רגישים במידה מספקת.

תוצאות המדידות מצביעות על השתתפות נוגדנים נגד טירוזינאז בתגובה החיסונית כלפי נוגדנים אנטי-אידיוטיפיים המחקים את מבנה האנטיגן HMWMAA. ניטור התגובה הספציפית כלפי הנוגדן האנטי-אידיוטיפי, המתבטאת ביצירת נוגדנים אנטי-אנטי-אידיוטיפיים (נוגדן 3, המזהה אנטיגן HMWMAA על פני תא המלנומה) נעשה באמצעות מדידת עיכוב יצירת הקומפלכס AB1-AB2 , כפי שהוצע על ידי מחברים אחדים [29,80,81] . מדידת כייל הנוגדנים נגד חלבון עכבר (HUMAN ANTI-MOUSE ANTIBODIES , HAMA )  [29,80] לא בוצעה מאחר ולא תוארה כבעלת משמעות קלינית, לא מבחינת אלרגיה ולא מבחינת תגובה נגד מלנומה. השינוי בכייל הנוגדנים נגד טירוזינאז ניתן ליישום בהערכת התגובה לחיסון בנוגדנים אנטי-אידיוטיפיים המחקים את האנטיגן ה "גבה-מולקולרי". כייל הנוגדנים נגד טירוזינאז עלה לאחר תחילת החיסון, ובהמשך ירד, ככל הנראה עקב ספיחה של הנוגדנים למטרות אנטיגניות על פני תאי מלנומה ומלנוציטים תקינים. הירידה בכייל הנוגדנים נגד טירוזינאז יכולה לנבוע מספיחה של הנוגדנים לאנטיגנים מתאימים או מירידה בייצורם במהלך הטיפול, תוך שמירה על פינוי קבוע ממחזור הדם. לעניות דעתנו נבעה הירידה בכייל מספיחה לאנטיגנים על פני תאי מלנומה או מלנוציטים. הנחתנו נתמכת על ידי התצפית של הופעת כתמי התבהרות (MAH ) ושל הנסיגה במחלה במקביל לירידה בכייל הנוגדנים.

השלב הראשון של התגובה החיסונית נגד הנוגדן האנטי-אידיוטיפי הינה יצירה של מערך נוגדנים נגד מלנומה, ועקב קיום אנטיגנים משותפים למלנומה ולמלנוציטים (CROSS  ANTIGENICITY ) , גם נגד מלנוציטים. תבחין ה- ELISA מודד את הנוגדנים הנוצרים בשלב הזה. השלב השני הוא פעילות הנוגדן נגד המטרה האנטיגנית : ספיחה, קשירת משלים או משיכת תאים ציטוטוקסיים. התגובה הקלינית , נסיגה והתפתחות כתמי התבהרות, משקפת את הפעילות בשלב השני. קיום השלב הראשון אינו מחייב בהכרח את קיום השלב השני. בחולים רבים נצפים שינויים בכייל הנוגדנים אולם ללא תגובה קלינית עוקבת.

חיסון בנוגדנים אנטי-אידיוטיפיים עשוי להוליד תגובה חיסונית באמצעות מנגנונים אחדים.

1.         ייצור וספיחה של נוגדנים אנטי-אנטי-אידיוטיפיים (נוגדן מספר 3) לאנטיגנים על פני תאי מלנומה (למשל אנטיגן HMWMAA ) , קשירת משלים ופרוק תאי מלנומה. טירוזינאז השתחרר מהתאים המפורקים, נחשף למערכת החיסונית ועורר יצירת נוגדנים נגדו, דבר שהתבטא בעליית הכייל. הנוגדנים נספחו לטירוזינאז (קשור או חופשי) והכייל ירד.

2.         ספיחת נוגדנים אנטי-אנטי-אידיוטיפיים לאנטיגנים על פני מלנומה ועירור תגובה תאית באמצעות הנוגדנים הספוחים (ANTIBODY MEDIATED CYTOTOXICITY ) .

3.         השראת תגובה רב-שבטית של תאי B ויצור נוגדנים שונים נגד מלנומה, ובכללם נוגדנים נגד טירוזינאז. נוגדנים נגד אנטיגנים על פני תאי B16 נוצרו אף הם ככל הנראה, אולם לא הראו שינוי ולא מגמה בכייל , שהיו בעלי מובהקות סטטיסטית. השראת הפעילות הרב-שבטית של תאי B בתגובה לגירוי אנטיגני מוכרת במקרים של הדבקה בנגיף EBV [102], בהם נוצרים נוגדנים הטרופיליים ונוגדנים נגד EBV , ובמקרים של מחלות אוטואימוניות. במסגרת עבודה אחרת שבוצעה במעבדתנו, נוגדן אידיוטיפי נגד דנ"א שהוזרק לעכבר, עורר תגובה חיסונית רחבת-טווח. נמצאו נוגדנים נגד שריר חלק, נוגדנים נגד דנ"א ונגד היסטון, הדומים לנוגדנים המצויים בנסיוב חולים בזאבת אדמנתית מערכתית (SLE ) . ייצור הנוגדנים לווה בהופעת סימנים של זאבת [74,108,109]. בדומה לכך, חיסון עכברים באמצעות נוגדן אנטי-קרדיוליפין הביא להתפתחות נוגדנים נגד קרדיוליפין, נוגדנים נגד פוספטידילסרין ולופוס אנטי-קואגולנט, כפי שנצפה בחולים עם תסמונת אנטי-פוספוליפיד [8,14]. במקרה של מלנומה , נוגדן אנטי אידיוטיפי המחקה אנטיגן של מלנומה (HMWMAA ) הביא ליצירת נוגדן אחר לחלוטין, נוגדן נגד טירוזינאז. נוגדן זה, נטל ככל הנראה חלק בתגובה החיסונית נגד המחלה (שהתבטאה בנסיגה של הגרורות)  ונגד המלנוציטים הבריאים של החולה (שהתאפיינה בהתפתחות כתמי התבהרות). ההבדל הבולט בין התגובה הרב-שבטית במחלות אוטואימוניות לבין התגובה הרב-שבטית לחיסון בנוגדנים אנטי-אידיוטיפיים הוא התוצאה הנגרמת בשני המצבים. במחלות אוטואימוניות הנוגדנים הנוצרים מביאים להאצה בקצב המחלה , ובמלנומה גורמים הנוגדנים דוקא לנסיגה של המחלה . הופעת ההתבהרויות הנלוות למלנומה מקבילה, למעשה, להחמרה במחלה האוטואימונית, אולם מרמזת על פרוגנוזה טובה יותר של החולה.

בכ- 5% מחולי המלנומה  מופיעים איזורי התבהרות במקומות שונים בעור, הדומים מאד לכתמי ההתבהרות בבהקת אוטואימונית. המשמעות של התפתחות אזורי התבהרות דמויי בהקת באופן ספונטני  melanoma-associated hypopigmentation  (MAH ) , בחולים עם מלנומה, שנויה במחלוקת. בהקת  (vitiligo) באוכלוסיה הכללית, בניגוד לאיזורי התבהרות בחולי מלנומה, הינה מחלה אוטואימונית, בה מתפתחים נוגדנים עצמוניים נגד מלנוציטים בריאים, ונגרם הרס שלהם [72,92,116]. כייל הנוגדנים נגד מלנוציטים נמצא במתאם למידת חומרתה של הבהקת [82,90]. בהקת קשורה בהתפתחות מחלות אוטואימוניות אחרות כגון יתר-תריסיות, תת-תריסיות, אנמיה פרניציוזית, התקרחות ממוקמת, היפופאראתירואידיזם וסכרת [45]. בחולים עם בהקת עשויים להמצא נוגדנים סגוליים לרקמות שונות, כגון נוגדנים נגד ציטופלסמה של בלוטת יותרת הכליה, נוגדנים נגד ציטופלסמה של תאי בלוטת המגן, נוגדנים נגד תירוגלובולין, נוגדנים נגד תאים פריאטליים ואחרים [13,15]. המצאות נוגדנים בעלי כושר פעולה נגד תאי מלנומה בנסיובי חולים עם בהקת אוטואימונית הוכחה לאחרונה במעבדתנו ע"י Fishman ועמיתיה [30]. נוגדנים שהופקו מנסיוב חולי בהקת נספחו לתאי מלנומה, ובנוכחות משלים, הביאו להרס תאים אלה. יכולת הנוגדנים הללו להרוס תאי מלנומה הודגמה בעכברים נושאים גרורות ראתיות של מלנומה [30]. הוצע בספרות כי נוגדנים בחולים עם מלנומה בעלי יכולת להרוס תאי פיגמנט ממאירים, ואפילו מלנוציטים תקינים,וליצור אזורי התבהרות [68]. יכולת זו הינה גורם פרוגנוסטי טוב [24]. אף אנחנו הנחנו כי בחולי מלנומה עם איזורי התבהרות קיימים נוגדנים נגד תאי מלנומה, הניתנים למדידה באמצעות ELISA, וכי נוכחותם מרמזת על מהלך פחות אלים של המחלה.

בעבודתנו נמצא כי רמת הנוגדנים נגד תאי מלנומה ונגד טירוזינאז בנסיוב חולים עם בהקת היתה גבוהה באופן מובהק מרמת הנוגדנים נגד תאי מלנומה ונגד טירוזינאז בנסיוב חולי מלנומה. לעומת זאת, לא נמצא הבדל משמעותי ברמת הנוגדנים נגד תאי מלנומה ונגד טירוזינאז בנסיוב בין חולי מלנומה עם איזורי התבהרות לבין חולים ללא איזורי התבהרות. נוגדנים נגד תאי מלנומה ונגד טירוזינאז נספחים על ידי מלנוציטים בכל אחד מהמצבים: בהקת, מלנומה ומלנומה מלווה ב- MAH . מאחר וייצור הנוגדנים בבהקת אוטואימונית רב יותר מיצורם במלנומה עם או ללא איזורי התבהרות, קיים עודף של נוגדנים חופשיים בנסיוב רק בבהקת, ולכן המדידה מראה כייל גבוה במיוחד. במלנומה עם או ללא איזורי התבהרות רוב הנוגדנים ספוחים למטרותיהם והכייל של הנוגדנים החופשיים אינו שונה למעשה מהכייל באוכלוסיית הבקורת.  הסיבה לכך שפעילות הנוגדנים בחולה מסויים מביאה להתפתחות MAH , ובחולה האחר, בעל אותו כייל נוגדנים, לא מתרחש תהליך זה, אינה ברורה [78].

איזורי התבהרות הושרו על ידי טיפולים שונים שניתנו לחולים במלנומה: כריתת קשריות לימפה נגועות, מתן אינטרפרון אלפא אג'ובנטי במשך שנה לחולה מלנומה לאחר הסרת הנגע הראשוני, מתן חיסון בנוגדנים אנטי-אידיוטיפיים המכוונים נגד האנטיגן הגבה-מולקולרי (HMWMAA ) לחולה במלנומה מפושטת. בשלושת המקרים הללו לא נמצאה כל עדות למחלה בעת אבחנת איזורי ההתבהרות. במקרה הראשון הושאר החולה ללא עדות למחלה, במקרה השני לא נשנתה המחלה תוך כדי או בתום הטיפול האג'ובנטי, ובמקרה השלישי הושגה הפוגה שלמה ונסיגה מלאה של הגרורות. תצפית דומה פורסמה על ידי  Hornung בשנת 1974 : איזורי התבהרות הופיעו בשימפנזים שחוסנו בתאי מלנומה [47].  המנגנון להשראת איזורי ההתבהרות נובע מ- CROSS ANTIGENICITY בין תאי מלנומה ומלנוציטים בריאים, ומ- CROSS REACTIVITY של הנוגדנים שנוצרים נגד מלנומה כחלק מהתגובה החיסונית נגדה, ופעילים גם נגד המלנוציטים הבריאים.

במקרה הראשון נכרתו קשריות לימפה נגועות, וסולקו למעשה רוב תאי המלנומה מהגוף. ששה חודשים לאחר מכן נצפו איזורי התבהרות. הנוגדנים נגד המלנומה שנקשרו קודם בעדיפות לתאי המלנומה, נקשרו לאחר הכריתה למלנוציטים בריאים וגרמו להם לההרס, ולכתמי ההתבהרות להופיע. במקרה השני ניתן אינטרפרון אלפא כטיפול אג'ובנטי לחולה לאחר סילוק הנגע הראשוני. אינטרפרון אלפא משרה יצירה וביטוי של מולקולות תאום הרקמות (MHC CLASS I ) ושל אנטיגנים על פני תאי הגידול. כמו כן מגביר את יצירת הנוגדנים על ידי עירור תאי B. הנוגדנים נגד המלנומה נספחו למלנוציטים בריאים בהיעדר תאי מלנומה בגוף (מדובר בטיפול אג'ובנטי). כתמי ההתבהרות נצפו לקראת סוף שנת הטיפול באינטרפרון. במקרה השלישי, ניתן חיסון בנוגדן אנטי-אידיוטיפי , נוצרו נוגדנים נגד אנטיגנים של מלנומה, ופעלו נגד המלנומה עד להשגת תגובה מלאה, ונגד מלנוציטים עד להופעת איזורי התבהרות . בספרות מופיעים דווחים על השראת MAH על ידי טיפולים שונים. בסדרה של Hornung הוזרקו תאי מלנומה במקום אנטיגן ספציפי (או נוגדן אנטי-אידיוטיפי המחקה מבנה של אנטיגן ספציפי) והתפתחה תגובה נגד תאי המלנומה. הנוגדנים נקשרו גם למלנוציטים התקינים והרסו אותם. Atkin [113] , Khayat  [113] ו-  Legha   [113] תיארו מקרים  של MAH שהתפתח תוך כדי או לאחר טיפול חיסוני באינטרלויקין- 2.  Kielholtz [113] דווח על הופעת MAH ממוקם לאיזורי הקרנה או כוויות שמש ב- 4 מתוך 65 חולים במלנומה.

עדויות לשפור הפרוגנוזה בעקבות הופעת איזורי התבהרות נצפו בבעלי חיים. המלנומה התקדמה לאט יותר או נסוגה בבעלי חיים עם מלנומה, שפתחו איזורי התבהרות באופן ספונטני, כמו למשל בסוסים עם מלנומה אצלם נצפתה נסיגה עצמונית של המחלה [66]. Bystryn  הציע כי הופעת איזורי התבהרות בחולים עם מלנומה הינה נסיון של הטבע להשיג את מטרת הטיפול האימונותרפי [19]. מחברים אחדים סיכמו כי נוכחות איזורי התבהרות בחולי מלנומה משפרת את הפרוגנוזה [17,18,24,63,93].  Koh וחבריו מצאו שההשרדות למשך 5 שנים של 8 חולי מלנומה עם איזורי התבהרות היתה 60% לעומת 38% בחולים מלנומה אחרים עם חומרת מחלה דומה אך ללא איזורי התבהרות [63].  Nordlund וחבריו מצאו ש- 65%  מתוך 51 חולי מלנומה עם איזורי התבהרות שרדו לפחות 5 שנים, לעומת 50% מחולים אחרים עם מלנומה בלבד ששרדו תקופה כזאת [93].  Bystryn ועמיתיו מצאו כי ההשרדות הממוצעת המציאותית ל- 5 שנים בקרב חולי מלנומה עם איזורי התבהרות הינה 91 ±  7.1%, לעומת השרדות צפויה של 74.8% בהתחשב בגורמי הסיכון האחרים [17]. לא היה הבדל בהשרדות של חולים עם התבהרות טבעתית  halo-hypopigmentation  סביב הנגע הראשוני לבין הופעת איזורי התבהרות מרוחקים. כאשר הופיעו איזורי התבהרות בשלב מתקדם של המחלה, היתה הפרוגנוזה גרועה [17]. מחברים אחרים טענו כי לא היה הבדל בהשרדותם של חולי מלנומה עם איזורי התבהרות מול חולי מלנומה ללא איזורי התבהרות [65,95].  Khayat [113] טען כי הופעת MAH מסמנת פרוגנוזה טובה יותר: שיעור התגובה לטיפול חיסוני היה גבוה יותר (75% ) בחולים עם MAH לעומת 41% בחולים ללא MAH.  Legha [170] סבר לעומתו כי MAH נצפה הן בחולים מגיבים והן בחולים לא מגיבים לטיפול חיסוני, ואילו לדעתו של  Kirkwood [170]  התפתחות MAH כתגובה לטיפול קשורה בהשרדות של יותר מ- 7 שנים.

בסדרתנו, מהלך המחלה בחולה עם איזורי התבהרות, שהופיעו באופן ספונטני, היה דומה למהלך המחלה  הצפוי בהעדר איזורי התבהרות. למשל, חולה בן 80 לאחר קטיעת האגודל עקב נגע ראשוני במיטת הצפורן, פיתח תוך פחות משנה גרורות בקשרי הלימפה בבית השחי באותו צד, בבטן ובאגן. במקביל הופיעו איזורי התבהרות בעור הבטן והחזה. בבדיקת דגימת הנסיוב מדמו לא נמצאו נוגדנים נגד מלנומה ברמה גבוהה יותר מאשר הרמה בנסיוביהם של חולים אחרים. תגובה מינימלית לטיפול באינטרפרון לא התבטאה בעליית רמת הנוגדנים החופשיים. התוצאות שהושגו עם נוגדנים נגד תאי B16 ונגד טירוזינאז, לפיהן רמות נוגדנים נגד תאי מלנומה B16 ונגד טירוזינאז דומות נמצאה בשתי קבוצות החולים, מרמזות על מצב אימונוביולוגי דומה בשתי הקבוצות . מפאת המספר הקטן של החולים בסדרתנו לא ניתן להסיק מסקנות בקשר ליתרון כלשהו לטובת החולים עם איזורי התבהרות הספונטניים. מאחר וחלק גדול מהחולים עם מלנומה ואיזורי התבהרות בסדרתנו עדיין בחיים, לא ניתן לקבוע את ההשרדות החציונית שלהם.

הופעה מושרית של איזורי התבהרות, בניגוד להופעה ספונטנית, עשויה להיות קשורה בפרוגנוזה טובה יותר, מאחר ומלווה בהקטנה של העומס הגידולי ע"י הטיפול. במידה והופעה ספונטנית של איזורי התבהרות מלווה בנסיגה קלינית של המחלה, או מתרחשת במהלך המחלה זמן רב לאחר טיפול כלשהו, ולחולה אין עדות לקיום מחלה בזמן הופעת ההתבהרויות, קיימת  אפשרות לפרוגנוזה טובה יותר.  גם בסוג זה של התבהרות, מספר החולים אצלם ניצפתה התופעה היה קטן מכדי להסיק מסקנות ברורות ביחס למשמעותה הפרוגנוסטית.